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細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定方法

1、計(jì)數(shù)器測(cè)定法
即用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。取一定體積的樣品細(xì)胞懸液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)室內(nèi),用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的(0.1mm3),因而根據(jù)計(jì)數(shù)器刻度內(nèi)的細(xì)菌數(shù),可計(jì)算樣品中的含菌數(shù)。本法簡(jiǎn)便易行,可立即得出結(jié)果。本法不僅適于細(xì)菌計(jì)數(shù),也適用于酵母菌及霉菌孢子計(jì)數(shù)。
2、電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法
電子計(jì)數(shù)器的工作原理是測(cè)定小孔中液體的電阻變化,小孔僅能通過一個(gè)細(xì)胞,當(dāng)一個(gè)細(xì)胞通過這個(gè)小孔時(shí),電阻明顯增加,形成一個(gè)脈沖,自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上。該法測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確,但它只識(shí)別顆粒大小,而不能區(qū)分是否為細(xì)菌。因此,要求菌懸液中不含任何碎片。
3、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法
常用的有平板菌落計(jì)數(shù)法,是根據(jù)每個(gè)活的細(xì)菌能長(zhǎng)出一個(gè)菌落的原理設(shè)計(jì)的。取一定容量的菌懸液,作一系列的倍比稀釋,然后將定量的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng),根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù),可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高,是一種檢測(cè)污染活菌數(shù)的方法,也是目前國(guó)際上||許多國(guó)家所采用的方法。
使用該法應(yīng)注意:
①一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),過多或過少均不準(zhǔn)確;
②為了防止菌落蔓延,影響計(jì)數(shù),可在培養(yǎng)基中加入0.001%一氯化三苯基四氮唑(TTC);
③本法限用于形成菌落的微生物。
廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細(xì)菌檢驗(yàn),是最常用的活菌計(jì)數(shù)法。
4、比濁法
比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比,與光密度成正比,所以,可用光電比色計(jì)測(cè)定菌液,用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。此法簡(jiǎn)便快捷,但只能檢測(cè)||含有大量細(xì)菌的懸浮液,得出相對(duì)的細(xì)菌數(shù)目,對(duì)顏色太深的樣品,不能用此法測(cè)定。
5、測(cè)定細(xì)胞重量法
此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱重;干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后,以清水洗凈放人干燥器加熱烘干,使之失去水分然后稱重。此法適于菌體濃度較高的樣品,是測(cè)定絲狀真菌生長(zhǎng)量的一種常用方法。
6、測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量
氮、碳是細(xì)胞的主要成分,含量較穩(wěn)定,測(cè)定氮、碳的含量可以推知細(xì)胞的質(zhì)量。此法適于細(xì)胞濃度較高的樣品。
7、顏色改變單位法(colour change unit,簡(jiǎn)稱CCU)
這種方法通常用于很小,用一般的比濁法無法計(jì)數(shù)的微生物,比如支原體等,因?yàn)橹гw的液體培養(yǎng)物是完全透明的,呈現(xiàn)為清亮透明紅色,因此無法用比濁法來計(jì)數(shù),由于支原體固體培養(yǎng)很困難,用cfu法也不容易計(jì)數(shù),因此需要用特殊的計(jì)數(shù)方法,即CCU法。
它是以微生物在||培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo),來計(jì)數(shù)微生物的相對(duì)含量的,下面以解脲脲原體為例,簡(jiǎn)單介紹其操作:
1)取12只無菌試管,每一管裝1.8ml解脲脲原體培養(yǎng)基。
2)在第一管加入0.2ml待測(cè)解脲脲原體菌液,充分混勻,從中吸取0.2ml加入第二管,依次類推,10倍梯度稀釋,一直到最末一管。
3)于37度培養(yǎng),以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測(cè)菌液的CCU,也就是支原體的最大代謝活力,比如第六管出現(xiàn)顏色改變,他的相對(duì)濃度就是10的6次方CCU/ml。
一般來說,比濁法和菌落計(jì)數(shù)法就可以滿足絕大多數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù),但是對(duì)支原體這樣比較特殊的微生物,用CCU法比較合適。測(cè)定微生物生長(zhǎng)的方法很多,各種方法均有其優(yōu)缺點(diǎn),也不是在任何情況下都適用。在微生物學(xué)工作中一般常用的是平皿菌落計(jì)數(shù)法、計(jì)數(shù)器法和比濁法。至于哪種方法比較適合,還得根據(jù)具體條件而定。
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